作者：張毅

      褪黑素是一種生物調制激素，對睡眠、促進性腺發育和生理節奏具有重要作用。低水平的褪黑素已被證明在帕金森病( PD)，失眠、癲癇、缺血性損傷和神經障礙有治療作用，此外，角色為褪黑激素在白內障的發展，衰老和視網膜炎也被報道。除動物來源外，從90年代開始，人們陸續在許多高等植物中也發現了褪黑素的存在，包括大多數食用植物、部分菊科植物、藥用植物以及一些植物種子中也發現了褪黑素的存在，其中藥用植物中褪黑素的含量較高。

    研究褪黑素的檢測方法，可以鑒定相關天然食品褪黑素的含量，評估相關食品的合理飲食量，同時也可以檢測在中草藥中也有非法添加的褪黑素。目前非法添加化學物質已成為中藥制劑造假的主要方式，例如在鎮靜安眠類中添加地西泮、艾司唑侖、氯硝西泮、褪黑素等，這屬于藥品監管部門嚴厲打擊的對象。

    目前，測定褪黑素的方法很多，如高效液相色譜-質譜法( HPLC-MC)、毛細管電泳法(CE)、

氣相色譜-質譜法( GC-MS)、熒光法、放射免疫分析法( RIA)、聯酶免疫分析法(ELISA)、光檢測

法、電泳法、以及電化學法等方法，試驗主要對褪黑素的檢測方法進行綜述。

1  褪黑素檢測方法

    進行褪黑素的檢測，首先從樣品中提取褪黑素。從樣品中萃取或提取的褪黑素有多種方法，常用簡單方法的萃取溶劑有乙醇、乙酸乙酯、甲醇、10%的Na2CO3磷酸鹽緩沖液。為了防止褪黑素在提取過程被氧化，也多采取在提取試劑中添加HC104、EDTA、和抗氧化劑的方法提取。在進行色譜分析之前同樣也需要進行前處理，以除去干擾物質，常用液-液萃取( LLE)方法提取褪黑素或者分離雜質，常用的萃取劑除雜，常用氯仿、甲醇等有機溶劑萃取并氮吹蒸干得到純度高物質。從生物體內或藥品中提取后的褪黑素經過前處理可用于分析測定，表1列出幾種不同褪黑素的檢測方法。

2色譜法

    色譜法( Chromatography)是測定褪黑素的常用方法，檢測速度快、精度高，具有檢測可靠的特點，但成本高和工作大。常用HPLC-MS, HPLC-FD, HPLC-ECD, LC-MS, GC-MS。

    目前對于褪黑素的檢測應用較廣為反相液相色譜。開展出液相色譜一三重四極質譜串  聯法( LC-MSIMS)檢測而啤酒，核桃，西紅柿和酸櫻桃樣品中的褪黑素及其同分異構體，檢測下限為9.6～52.9 ng/g或ng/mL; LC-FD檢測一系列廣泛品種的西紅柿和草莓，檢測出褪黑素質量濃度范圍為0.017～8.8 mg/L; Gonzalez-Gomezc以C18反相液相色譜柱檢測不同種類的櫻桃褪黑素含量，檢測下限為4.3 ng/mL; 用C18反相色譜柱一大氣壓力化學電離質譜串聯檢測葡萄皮、紅酒和植物中的褪黑素，最低LOD為0.12 pg; 開展出快速液相色譜串聯質譜法( LC-MSIMS)檢測海鰻中的褪黑素，檢測下限( LOD)分別為0.03 ng/mL。研究C18 BEH柱和通過在正離子模式下多反應監測電噴霧的質譜裝置執行的檢測意大利傳統芪葡萄產品中的褪 黑素及其同分異構體。

  3光檢測法

    光檢測法包括熒光檢測法、紫外檢測法、發光檢測法等方法。常與高效液相色譜( HPLC)串聯使用。GB/T 5009.170-2003規定了褪黑素的檢測方法，包括熒光檢測法和紫外檢測法。其中紫外檢測法的檢出下限為0.5 ng，取樣量濃度為0.5 g時，檢出質量濃度為0.07 mg/mL;熒光檢測法檢出下限為30 pg，其線性范圍為0.05 ng～0.50 ng。試驗主要介紹熒光檢測法和紫外檢測法。

  3.1熒光測定法

    熒光測定法( Fluorescenee detection，FD)是利用熒光物質吸收特征波長的光后發射熒光，通過測定其熒光強弱來進行定量分析。熒光測定法具有靈敏度高（靈敏度比分光光度法高1～3個數量級），選擇性高，線性范圍廣，以及測定結果與斑點形狀無關等優點，常與HPLC或LC等串聯使用。Jose發展了雙氯仿萃取前處理HPLC-FD法檢測鱒魚的腸道中的褪黑素，以避免在檢測不同組織的提取物的干擾，檢測下限為8 pg/mL。HPLC-FD可用于檢測108種草藥中的褪黑素，其中檢測出64種中藥所含褪黑素超過10 ng/g（干重），其中有39褪黑激素水平超過100 ng/g（干重），10種已經褪黑激素水平超過1 000 ng/g（干重）。Korkmaz探究了280 nm和350 nm的發射波長的熒光檢測器檢測在不同的生長階段分析在辣椒植物器官的褪黑激素的含量。

3.2紫外檢測法(UV)

    可見光、紫外線照射某些物質，主要是由于物質分子中價電子能級躍遷對輻射的吸收，而產生化合物的可見紫外吸收光譜?；�于物質對光的選擇性吸收的特性而建立分光光度法或稱吸收光譜法的分析方法。褪黑素屬于吲哚類芳香化合物，具有苯環和含氮雜環，能夠吸收紫外光產生和躍遷。對于褪黑素進行UV檢測的波長范圍從200~223nm，對褪黑激素的檢測限從2 mg/L—0.2ug /L。urmeian采用稱為“零交叉”技術的二階或三階導數紫外光譜分析法檢測褪黑素，線性范圍是0.5～3.5ug/mL; Amnj等開發出兩種簡單、快速、靈敏和精 確的紫外檢測方法，用鄰二氮菲亞鐵離子或三價鐵離子與2，2-連吡啶分別于pH 4.6或pH 2.5的乙酸鈉緩沖液中70℃時對MT衍生化反應10 min，然后分別在=510 nm或522 nm進行UV吸收測定，線性范圍分別是0.4～6.4ug /mL和0.4~7.4 ug/mL。

  4電化學分析法

    電化學分析( Electrochemical Analysis)，是儀器分析的重要組成部分之一。它是根據溶液中物質的電化學性質及其變化規律，建立在以電位、電導、電流和電量等電學量與被測物質某些量之間的計量關系的基礎之上，對組分進行定性和定量的儀器分析方法。

4.1電泳法

    電泳分析( CE)具有高效率、樣品體積小、分析時間短等優點，是一個非常重要的分離技術，特別是對于生物分子。它已經被應用于分離和測定的褪黑激素和相關的吲哚化合物。不同的CE檢測方法已經用于測定的褪黑激素、其前體、以及代謝產物。由于這些化合物的電活性，陽極電流檢測已成功在該范圍內使用的以及獲得非常低的褪黑素檢測限( 0.3~27 mg/L)。在0.025 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.3)12 min的條件中分離檢測褪黑素，所使用的工作電極是在一個壁射流配置操作的500-MUM直徑碳電極，檢出限為1.3×10-6 mol/L;  Ali通過使用熔融石英毛細電泳管( 60 cm×50 mm ID)、磷酸鹽緩沖液( 50 mmol/L，pH 3.0)作為背景電解質(BGE)、20 kV的電壓施加、UV檢測波長214 nm檢測褪黑素，其線性范圍是10～100ug /L。

4.2傳感器檢測法

    對于褪黑素的分析，傳感器分析具有速度極快、準確度高、前處理要求低、檢出下限低等特點。其原理是利用對褪黑素敏感的原件作為檢測頭，將褪黑素的濃度轉換成電信號，從而進行測定。

    利用摻硼金剛石電極，使用循環伏安法檢測褪黑素，在羅二氏緩沖劑、pH 3.0、正0.88 V（相對于Ag/AgCl電極）最佳條件下得到伏安響應，檢出下限為0.025ug /mL; 利用由多個掃描循環伏安組成的錳六氰基鐵酸鹽( MnHCF)的混合價的聚（3，4-亞乙基）(PEDOT)的混合膜( MnHCF-PEDOT)玻碳電極檢測褪黑素，線性范圍較廣( 0.1～0.46 nmol/L)，檢測下限低(0.01 nmol/L)，響應速度快(3 s)，具有易制備、特異性高、穩定性好和重復性好的優點；在弱酸條件下，以鄰苯二胺為功能單體，褪黑素為模板，以電化學聚合物法在鉑電極表面合成了性能穩定的褪黑素分子印跡聚合物膜，采用循環伏安法( CV)和差分脈沖法( DPV)對分子印跡傳感器的識別性能進行了研究，在1×10-8～1×10-10 mol/L的范圍內，褪黑素的濃度與K3Fe(CN)6的相對峰電流變化呈良好的線性關系，檢出限( LOD)為1×10-11mol/L。

5免疫分析法

    免疫分析法是利用特定抗體對被檢測物質特異性識別結合，通過直接或者間接檢測被檢物質的方法，具有檢測速度快、靈敏度高、成本低等特點。免疫分析法主要有放射免疫測定法和聯酶免疫分析法。免疫分析法對于褪黑素的分析目前主要針對動物體內血液。

5.1放射免疫測定

    放射免疫測定( Radioimmunoassay，RIA)是利用放射性核素的測量方法與免疫反應的基本原理相結合的一種放射性核素體外檢測法。該法有靈敏度高、特異性強、精確度佳及樣品用量少等優點，因而發展迅速，但由于這種方法具有放射性元素，故在食品檢測領域中的應用未見報道。

    通過用標記褪黑素單克隆抗體進行交叉反應測試，除與N-乙酰血清素一個0.81%交叉反應外，幾乎沒有與其他物質進行交叉反應，線性檢測范圍是50 pg～100 ng; 褪黑素標記物作為示蹤劑進行抗血清的特異性分析，線性范圍是0.022~0.345pmol/藥瓶；褪黑素檢測昆蟲血液中褪黑素的含量，檢測下限為40 pg/mL; 褪黑素和多克隆兔抗褪黑素血清結合的方法，測定雞血液和松果體中的褪黑素含量；褪黑素與高親和力特異性抗羊血清抗體結合，檢測各種動物中松果體褪黑素含量，檢測下限為0.005 pmol/ mL，分別獲得大鼠、倉鼠、綿羊和龜松果體勻漿平行抑制曲線。

5.2聯酶免疫分析法(ELISA)

    酶聯免疫吸附測定( Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測方法。ELISA包括競爭法、雙抗體夾心法、抑制性測定法、間接性測定法等方法。

    設計用單克隆抗體ash-10對褪黑素進行ELISA檢測，方法為高碘酸氧化法辣根過氧化物酶( HRP)標記的直接競爭的ELISA方法，為提高靈敏度，褪黑素與堿性磷酸酶共軛，檢測下限為100 ng/mL; 褪黑素與牛血清白蛋白( BSA)進行偶合，注入Balb/c小鼠腹腔內進行免疫，其脾細胞產生抗體的高效價融合與SP2/0骨髓瘤起源細胞，制備兩種穩定單克隆AS-H10和AS-D26，構建出一個廣泛的線性檢測范圍(10 ng/mL～10 g/mL)；甲醛將褪黑素和牛血清蛋白進行偶合，用多焦點真皮內注射免疫Balb/c小鼠，通過PEG誘導的融合的免疫PLN和SP2/0細胞選擇了陽性細胞株和所確定的單克隆抗體對MT的效價，獲得5株能分泌高特異性抗體的雜交瘤細胞，用于ELISA檢測。

6結語與展望

    隨著我國經濟發展和國民生活水平提高，群眾對健康生活和保健食品的需求也日益增加。自然界中許多動植物都含有褪黑素，由于對于動植物中的褪黑素含量了解甚少，因此不能評估合理有效的進食量。同時，褪黑素類產品已經在國外廣泛應用，幾年來我國也開始大量開發生產該類產品。為達到保證褪黑素類產品的質量、保護消費者身體健康的目的，必須發展褪黑素的檢測方法。

目前對于褪黑素檢測多數是采用儀器分析法，當中高效液相色譜法( HPLC)最為普遍。儀器分析法具有靈敏度高，回收率高，線性范圍好，準確度高的優點。但由于儀器檢測前需要進行復雜的前處理以及高成本等因素，一定程度上限制了褪黑素的檢測。對于ELISA和電化學傳感器這些快速檢測方法，優點在于前處理要求相對較低，速度快，但多數是針對人體血液或其他動物器官中的褪黑素檢測，專門針對食品基質中褪黑素檢測的檢測方法較少。因此發展電化學傳感器、RIA、ELISA等快速檢測方法來進行食品中褪黑素的檢測是未來對于褪黑素檢測發展的趨勢。

7摘要

褪黑素作為一種主要是由哺乳動物和人類的松果體產生的一種胺類激素，具有安眠、抗衰老、抗腫瘤等作用，常作為輔助睡眠保健食品的功能因子之一，西紅柿、葡萄等食物中也含有褪黑素。研究褪黑素的檢測方法，可以鑒定相關天然食品褪黑素的含量，評估相關食品的合理飲食量，也可鑒定保健食品中褪黑素含量是否超標或不達標以及中草藥中非法的褪黑素。因此對褪黑素的檢測具有重要意義。對褪黑素的來源和功能做簡單介紹，重點對褪黑素的檢測方法研究進展進行了綜述。