作者：鄭曉敏

    大量研究表明，預處理所產生的抑制物質會影響酵母的正常生長和后續的發酵過程。因而，研究預處理后水解液中的抑制物組成成分，并尋找有效的脫毒方式，對于進一步提升木質纖維素降解率和生物乙醇產率具有重要意義。

    目前，人們對不同原料在各類預處理方法與條件下所產生的抑制物已有廣泛研究，但主要集中在稀酸、蒸汽爆破、碳酸鈉一氧化水解等預處理手段。例如，Larsson等用稀硫酸在高溫蒸汽下水解云杉，發現主要水解液中的主要抑制物為乙酸、甲酸、乙酰丙酸、糠醛和羥甲基糠醛等；Martin等用蒸汽爆破一酶解法處理甘蔗渣，發現乙酸、甲酸、糠醛、羥甲基糠醛、酚類化合物等為主要抑制物；Klinke等[8]用碳酸鈉一氧化水解法水解麥草，結果表明乙酸、甲酸、羥基乙酸、蘋果酸、酚類化合物等為主要抑制物。然而，關于氫氧化鈉預處理對木質纖維素水解液中抑制物組成成分的影響和水解液中主要抑制物的研究少有報道。

    本課題組前期研究結果表明，氫氧化鈉預處理是一種較為有效的稻草秸稈生產燃料乙醇過程中的預處理手段，其最優預處理條件為：NaOH濃度為2%( w/w)，溫度為85℃時處理l h。文章采用萃取濃縮一氣相色譜質譜聯用技術(EE-GCfMS)，對經最優條件下堿預處理后和未經堿預處理的稻草秸稈水解液中的抑制物組成成分進行了初步研究，并分析了主要抑制物的抑制機理和抑制作用，可為針對性消除堿預處理時產生的有毒抑制物對后續酵母發酵產燃料乙醇的不良影響提供一定的科學依據。

  1實驗部分

  1.1材料與方法

  1.1.1稻秸原料的采集

    稻草秸稈于2013年10月采自上海市閔行區吳涇鎮的農田。帶回實驗室用清水洗凈3遍，去除稈節，烘干后備用。

  1.1.2稻草秸稈水解液的制備

    用粉碎機將稻秸粉碎，并過40'目篩，取所得樣品10 g于具塞三角燒瓶中；添加100 mL 2%(w/w)氫氧化鈉溶液于該燒瓶中，85℃水浴加熱處理樣品th，室溫冷卻靜置20 min。添加等量純水的空白樣作為對照組。

  1.1.3稻草秸稈水解液的萃取濃縮

    取靜置后上層溶液40 mL，在Thermo冷凍離心機上在25℃（室溫）溫度條件下以4 500 r/min離心5mm;取離心后清液30 mL于分液漏斗中，在各分液漏斗中分別加1.5 mol/L的硫酸溶液將其pH調至2左右，以使酚鈉鹽成為酚類物質，再分別加入7.5 g硫酸銨（提高萃取率）、20 mL二氯甲烷，振蕩萃取10 min，靜置10 min;取下層萃取液15 mL于離心機上原速離心5 min;取10 mL離心后清液于試管中，加入等量的硫酸溶液進行酸洗；取下層酸洗后的清液8 mL于40℃下蒸發濃縮30 min左右至0.5 mL，用于Agilent7890A氣質聯用儀(GC-MS)的進樣測定。

1.2 GC-MS分析

1.2.1  GC條件

    色譜柱：HP-5MS(30 mx0.25 mmx0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣：He(99.999%)；恒流，柱流量：1.0mL/min；分流模式：不分流；進樣量：1.0μL;進樣口溫度：250℃；柱始溫60℃，保留0 min，程序升溫以8℃/min升至180℃，保持2min，程序升溫以7℃／min升至250℃，保持2 min;輔助加熱區2打開，初始溫度280℃，方法總運行時間為29 min。

1.2.2質譜條件

    離子源：EI源；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；色譜一質譜連接口溫度：280℃；電子能量：70eV;電子倍增器電壓l 500 V;溶劑延遲時間：4 min;掃描方式：全掃描，掃描質量數范圍是：35～400，閾值為200。

2結果與討論

    文章依據Palmqvist、Larsson、Heer、Klinke、Rasmussen等的研究基礎與分類標準進行分類，將主要由木質素降解產生的帶有酚結構的物質統稱為酚類，其中又可依據所含官能團分為酚醛、酚酮、酚酸等，將主要來自于纖維質的脂肪酸等簡稱為酸類，將主要來自于纖維質的呋喃衍生物（酸處理時為呋喃醛）稱為呋喃類，其它物質根據各自官能團進行分類。

2.1堿預處理前后稻草秸稈水解液中抑制物組成成

分分析

    對照組和經過2%氫氧化鈉預處理的稻草秸稈水解液的總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示。每個濃度組設置3個平行實驗，每個平行樣進3針，圖庫檢索時每組去除非重復9次出現的幾種物質。根據NIST11質譜數據庫檢索，對兩組水解液中的抑制物組成成分進行鑒定，應用峰面積歸一法確定各自的相對含量，分別如表l和表2所示，表中的保留時間指的是出峰時間，匹配度反應的是每個峰的離子圖和NIST11圖庫中檢索到的已知標準物離子圖的相似度，匹配度達到80%即較為可信，每組匹配度選擇9個數據中的最小值；相對含量為每種物質對應峰積分面積占總積分面積的百分比，表中取9個相對含量數據的平均值；標準差是以上9個相對含量數據的標準差。每組的平行實驗數據顯示：不超過3種物質在圖庫檢索時非重復出現，各平行實驗中物質保留時間相差小于0.2 min，大部分物質相對含量的標準差較小，各組平行實驗數據間不存在顯著差異。

2 .1.1對照組稻草秸稈水解液中抑制物組成成分

    共鑒定出對照組稻秸水解液中的23種抑制物，它們可以分為8個類別。包括酚類化合物3種，按相對含量排列分別為：香草醛>2，4-二叔丁基苯酚>丁香醛；酸類化合物4種，分別為：十六烷酸(占大部分：14.90%)>己酸>苯甲酸>十八烷酸(0.92%)；酮類化合物5種，分別為：4-羥基-3，5，5-三甲基-4-( 3-酮-1-丁烯基）-2-環己烯-1-酮>3-甲基-4-乙烯基-1H-吡咯-2，5-二酮>植酮>4-(2，6，6-三甲基-1，3-環己二烯-1-基)-3-丁烯-2 -酮>大馬士酮(0.90%)；烷烴類化合物3種，分別為：正二十四烷（占大部分：29.89%）>正二十烷>正十九烷(0.59%)；呋喃類化合物4種，分別為：二氫獼猴桃內酯>2，3-二氫-2-甲基苯并呋喃>丙位己內酯>丙位戊內酯，后面2種低于1%；酰胺類化合物1種，為N-丁基苯磺酰胺(4.58%)；萘類化合物1種，為1，2，3，4-四氫一l，l，6-三甲基萘(0.64%)；此外還有酯類化合物2種，分別為：鄰苯二甲酸二丁酯（占大部分：4.73%）>磷酸三丁酯(0.69%)。

2 .1.2經過2%氫氧化鈉預處理的稻草秸稈水解液中抑制物組成成分

    共鑒定出經堿預處理稻草秸稈水解液中的30種抑制物，它們可以分為6個類別。包括酚類化合物10種，按相對含量排列分別為：阿魏酸（占大部分：43.79%）>香草醛>乙酰丁香酮>2-甲氧基-4-乙烯基苯酚>丁香醛>對羥基苯甲醛>香草乙酮>2，4--叔丁基苯酚>4-乙基間苯二酚=水楊酸(0.1%)，后4種均低于1%；酸類化合物8種，分別為：十六烷酸（占大部分：18.13%）>亞麻酸>亞油酸>十八烷酸>苯甲酸>十七烷酸>十五烷酸>十四烷酸，后面2種低于1%；酮類化合物8種，其中巨豆三烯酮（占大部分：2.71%）>甲基環戊烯醇酮>植酮>大馬士酮>2，5-己二酮>3-甲基-2-環戊烯-1-酮>乙基環戊烯醇酮=環戊烷-1，2-二酮(0.09%)，后面7種均低于1%；呋喃類化合物1種，為二氫獼猴桃內酯(0.37%)；酰胺類化合物2種，分別為：雙五亞甲基尿素>油酸酰胺，均低于1%；萘類化合物1種，為l，2，3，4-四氫-1，1，6-三甲基萘(0.15%)。以上對于相對含量低于1%的物質都有標明。

2.2堿預處理前后稻草秸稈水解液中抑制物按類別的組成成分對比及抑制作用分析

    由于水解液中物質的復雜性，確定其中抑制物總質量和各個成分的質量存在很大困難，但可以借助各個處理組總離子流圖的總積分面積來近似描述抑制物總量，結合總離子流圖1、2中的物質峰高和對照組總積分面積：( 3.97x108+3.90xl07)及堿預處理組總積分面積：( 6.07xl09+5.92xl08)，可知堿預處理組水解液中的總抑制物量是遠多于對照組的，而且每個處理組的各平行實驗數據之間不存在顯著差異：堿預處理前后稻秸水解液中抑制物經分類后的相對含量對比情況如圖3所示，從圖3可以看出：堿預處理前后水解液中抑制物組成成分有著極大地變化，對照組的水解液中各類別物質相對含量分布更均勻，按相對含量排列分別為：烷烴類>酸類>酮類>酚類>呋喃類>酯類>酰胺類>萘類；經過堿預處理的水解液中酚類和酸類物質占據94.46%的總相對含量，成為最主要的抑制物，而其它類別物質的相對含量相比對照組均大幅降低，其中各類物質按相對含量排列分別為：酚類>酸類>酮類>酰胺類>呋喃類>萘類，烷烴類和酯類物質未檢測出；出現上述變化的主要原因可能是：NaOH溶液削弱纖維素和半纖維素間的氫鍵，引起木質素和半纖維素間的酯鍵發生皂化，破壞本質素結構，進而使得部分木質素與纖維質分解生成酚類和酸類物質。下文結合表1與表2對水解液中各類抑制物的抑制作用進行分析。

2.2.1酚類化合物

    酚類化合物的抑制作用很強，小分子量的酚類化合抑制作用最強。酚類化合物能滲透到細胞膜內，破壞細胞的完整性和活性，影響發酵微生物的正常生長，甚至導致死亡。經研究發現，酚單體上的脂肪族官能團取代基對酒精形成的抑制作用很明顯；而酮基、醛基、羧基等大部分取代基都加大其抑制作用。

    本研究中，經過堿預處理的稻秸水解液中酚類物質種類相比對照組從原來的3種增加到10種，經過堿預處理后新出現了7種對照組未檢出的酚類物質，總相對含量相比對照組顯著增加，從原來的10.87%增長至64.03%，增長率達489.05%．3種共有酚類物質對比后發現丁香醛（減少率為10.5%）和2，4-二叔丁基苯酚（減少率為92.9%）減少，而香草醛卻有所增加（增長率為10.8%）；新出現7種酚類物質中又以阿魏酸(43.79%)占主要組分，其次是乙酰丁香酮(6.63%)和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(3.14%)。從以上酚類物質的結構可以看出，它們都含有酮基、醛基、羧基等官能團，這些都很可能加大酚類物質對后續酒精發酵過程中酵母等的抑制作用。

2.2.2酸類化合物

    酸類物質在發酵過程中對微生物的抑制作用主要表現在：有機酸分子以簡單擴散的方式穿過細胞膜進入微生物細胞中，使細胞內環境酸化，消耗并透支ATP從而抑制細胞生長；Zaldivar等發現酸類對菌體生長的抑制作用隨pH的升高而減弱，并且酸類疏水性強則其抑制作用也強。

    本研究中，檢測出的酸類除苯甲酸外均為脂肪酸，而經過堿預處理的稻秸水解液中酸類物質相對含量比對照組有所增加，從原來的21.04%增加到30.43%,增長率為44.6%。酸類物質從原來的4種增長到8種，其中3種是共有的酸類物質，3種酸類物質中十六烷酸（增長率為21.7%）和十八烷酸（增長率為120.7%）相對含量增加，而苯甲酸卻有所減少（減少率為31.8%）；經過堿預處理的水解液中新增5種酸類物質，其中以亞麻酸(3.86%)和亞油酸(2.53%)占多數。但對照組的己酸(2.67%)在經堿預處理后的水解液中未檢測出。十六（八）烷酸、亞麻酸、亞油酸等疏水性強，結合它們較大的相對含量可知：經過堿預處理的稻秸水解液中酸類物質的抑制作用是相當大的。

2.2.3其它類物質

    經過堿預處理的水解液中除以上兩大類物質之外，酮類、烷烴類、呋喃類、酰胺類、萘類、酯類等物質的含量及抑制作用均較弱。

    本研究中的酮類均為脂肪酮或脂環酮，經過堿預處理的稻秸水解液中酮類（8種共4.31%）相比對照組（5種共18.54%）大幅下降，減少率為330.2%。烷烴類物質毒性相對較小，堿預處理后的水解液中未檢測出烷烴類物質。水解液中的呋喃類物質主要為呋喃酯類，其毒性較低，相對含量從6.95%下降到0.37%。部分酰胺類雖具有抗生素的作用，但是考慮到酰胺類物質可能產生于硫酸銨，而且相對含量從對照組的4.58%降到經過堿預處理的0.7%，因而其毒性作用不深人探究。萘類和酯類相對含量分別從0.64%和5.42%降至0.15%和0%，可見，這兩類物質的抑制作用在經堿預處理后均較低。

3結論

    (1)經過堿預處理的水解液中檢測出的抑制物為6類30種，對照組為8類23種；經過堿預處理后抑制物種類增多，但集中于少數幾類物質，對照組抑制物種類少但較為分散。

    (2)經過堿預處理的水解液中酚類和酸類物質種類比對照組明顯變多，酚類物質種類從3種增加到10種，酸類物質種類從4種增加到8種；相對含量相比對照組顯著增加，分別從10.87%及21.04%增長至64.03%及30.43%，同時由于這2類物質相對大的毒性，使得它們成為最優處理條件下的水解液中的主要抑制物。因而，對于酚類和酸類物質的去除是稻草秸稈生產燃料乙醇工藝中消除發酵抑制作用的關鍵。其中，酚類中的阿魏酸(43.79%)和酸類中的十六烷酸(18.13%)

含量最高，應考慮重點去除。其次，應該考慮去除的可能有乙酰丁香酮(6.63%)、2-甲氧基-4乙烯基苯酚(3.14%)、亞麻酸(3.86%)和亞油酸(2.53%)和巨豆三烯酮(2.71%)等。

(3)2% NaOH堿預處理對于稻秸水解液中抑制物組成成分和抑制作用產生了極大的影響，從總抑制物量、酚類和酸類的相對含量以及它們的毒性等綜合看來，其水解液中抑制物總抑制作用很可能強于對照組。  

4 摘要：

采用萃取濃縮一氣相色譜/質譜聯用技術( EE-GC/MS)對未經堿預處理與經過2% NaOH堿預處理的稻草秸稈水解液中抑制物組成成分進行了研究，旨在為解決堿預處理對木質纖維素原料生產燃料乙醇過程的抑制作用提供理論支持。研究結果表明，經過堿預處理的稻秸水解液中檢測出抑制物種類共6類30種，對照組共8類23種。其中，經過堿預處理的水解液中酚類和酸類物質種類比對照組明顯增多，酚類物質種類從3種增加到10種，酸類物質種類從4種增加到8種；相對含量亦比對照組顯著增加，酚類物質的相對含量從10.87%增長至64.03%，酸類物質的相對含量從21.04%增加到30.43%，成為最優堿預處理條件下的水解液中的主要抑制物，其中阿魏酸和十六烷酸相對含量最高，分別為43.79%及18 .13%；此外，其它類別的物質相對含量均大幅降低。綜合看來，經過堿預處理的水解液中抑制物總抑制作用強于對照組。