作者：鄭曉敏

     提示: 本研究實驗結果表明，當銅綠微囊藻受到Ni2+協迫時，葉綠素a含量顯著下降，其他研究結果也表明Ni2+能抑制銅綠微囊藻和集胞藻的光合色素合成；As3+加人后葉綠素a含量明顯低于對照，但在低濃度范圍內有一定的升高，隨后高濃度又開始下降，Mascher等對紅三葉草的研究也發現．低濃度砷處理時，植物的光合色素含量均有所提高．說明銅綠微囊藻和植物對低濃度的砷有一定的耐受佳，隨著砷濃度的增加，毒害作用趨于明顯。

    研究表明，水體中的Ni2+對M. aerugonisa的生長有抑制作用，降低葉綠素a和藻藍蛋白的含量，破壞電子傳遞鏈，導致ROS的產生。而砷通過磷轉運途徑進入細胞污染物能夠引起反常的皮膚、腸胃、神經問題，甚至能夠致癌。但Ni和As等重金屬污染物具有生物富集和積累的性質，研究快速其快速檢測方法，對于了解其對細胞的傷害，有重要指示作用。

    作為水體生態系統的初級生產者，銅綠微囊藻是一種常見的水華藻類，對污染物的脅迫反應敏感，可以很好地反映水體污染的程度。關于重金屬對銅綠微囊藻脅迫的研究在國內外已有大量的文獻報道，但對于葉綠素熒光技術的應用較少。目前，葉綠素熒光動力法具有快速、靈敏、對細胞無損傷且便于操作攜帶等優點而得到了廣泛的使用。葉綠素光誘導熒光作為光合作用的探針，與PSⅡ反應中心及反應中心電子供體側和受體側氧化還原狀態密切相關，能提供大量光合系統功能的信息。因此，本文利用快速葉綠素熒光動態分析技術，探討鎳和砷的脅迫下，銅綠微囊藻的光合作用色素含量和葉綠素光誘導熒光動力學特征的變化，同時分析鎳和砷作用在銅綠微囊藻電子傳遞鏈位點，對于分析不同重金屬污染的特性，并應用于污染物的環境監測中，有重要意義。

1材料與方法

1.1實驗材料

    銅綠微囊藻（M. aeruginosa）藻種來源于中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻類藻種庫( FACHB)，無菌操作將藻種轉接至新鮮滅菌過的BG-11培養基內，于光照培養箱中恒溫(20±1)℃，光強50 μE/(m2·s)，24 h持續光照培養至對數期。

1.2實驗方法

1.2.1鎳和砷對銅綠微囊藻的處理方法

    將培養至對數期的銅綠微囊藻無菌操作轉移至滅菌過的250 mL錐形瓶中，然后加入NiS04·6H2O，使Ni2+的終濃度為0、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/L，藻液密度為8.lxlOs個/mL，分別在0，24，48，72，96 h，測定銅綠微囊藻的葉綠素a含量和熒光參數。

    將培養至對數期的銅綠微囊藻無菌操作轉移至滅菌過的250 mL錐形瓶中，然后加入As302，使As3+的終濃度為0、0.5、l、2、3、5 mg/L，藻液密度為8.lx105個/mL，分別在0，24、48、72、96 h，測定銅綠微囊藻的葉綠素a含量和熒光參數。

1.2.2葉綠素a的測定

    葉綠素濃度的測定參照李合生等的方法。取5 mL處理后的藻液，8 000 r/min離心10 min后棄上清，收集藻體，加入等體積的95%乙醇，置4℃冰箱放置24 h，中間搖晃2—3次，離心(8 000 r/min，10 min)，用UV-2000型分光光度計在665 nm和649 nm波長下測定離

心后上清液的光密度值D666和D649，用公式C=13.7×D666 - 5.76×D649計算葉綠素a濃度，單位為μg/mL。

1.2.3熒光參數測定

    取經不同濃度Ni2+和As3+處理后的銅綠微囊藻培養物2 mL，暗適應15 mm，采用葉綠素熒光動力學參數采用便攜式植物效率分析儀(PEA，HanasatechR．U．K)于室溫下測定，激發光強為最大光強的50%(約1 500 μE/(m2·s))，記錄時間為5s。葉綠素熒光誘導動力學曲線反應了電子傳遞鏈參數的變化，除O-J-I-P的變化情況外，還可得到大量關于電子傳遞情況的原始數據，處理后可獲得關于PSII反應中心原初光化學反應的各種信息，各參數具體含義見表1。

1.2.4數據分析

    本文所有數據是多次平行實驗結果，取平均值，用origin作圖，并用One-Way ANOVE進行顯著性分析。

2結果與分析

2.1  不同濃度鎳和砷對銅綠微囊藻葉綠素a含量的影響

    如圖l所示，在加入Ni2+后，隨處理時間的延長及Ni2+濃度升高，葉綠素a含量顯著降低(p<0.05)；在處理l d時各處理組的葉綠素a含量均顯著低于對照組，在加入Ni2+后4 d，0.1 mg/L Ni2+處理組的葉綠素a含量比同期對照組降低56.5%，l mg/L Ni2+處理組降低了97.2%。在加入As3+后，隨處理時間的延長及濃度升高，葉綠素a含量仍然升高(p<0.05)，各處理組葉綠素a含量低于對照組，但各處理組除2 d時差異顯著外．其他并不顯著，如在加入As3+后4d時，0.5、l，5mg/L處理組的葉綠素a含量比同期對照組降低36.3%、22.4%、29.0%。結果表明Ni2+比As3+的作用效果明顯。

2.2  不同濃度鎳和砷對銅綠微囊藻光合活性(Fv/Fm)影響

    如圖2所示，在加入Ni2+后，隨處理時間的延長及Ni2+濃度升高，FV/Fm顯著降低；在處理l d時各處理組的Fv/Fm即顯著低于對照組，在加入Ni2+后4d，Fv/Fm值極顯著降低(p<0.01)。在加入As3+后，隨處理時間的延長及濃度升高,Fv/Fm仍然升高，但各處理組Fv/Fm低于對照組，各處理組除2d時差異顯著外，其他處理

時間并不顯著(p>0.05)。結果表明Ni2+比As3+對光合活性的作用效果要明顯。

2.3不同濃度鎳和砷對銅綠微囊藻葉綠素熒光動力曲線的影響

    由圖3可以看出，在經過Ni2+和As.3+處理后，銅綠微囊藻的葉綠素熒光強度和誘導曲線的不同相均發生了變化。在加入Ni2+第1天時銅綠微囊藻的熒光強度均顯著(p<0.05)降低，低濃度(<0.8 mg/L)處理組誘導曲線的J點和P點均顯著下降但并未消失，高濃度處理組的J點和P點基本消失，在經過Ni2+處理4d時熒光強度顯著降低，J相和P相均已基本消失，表明電子傳遞鏈受損嚴重。在加入As3+后ld時銅綠微囊藻的熒光強度均降低，各處理組的J相和P相均變弱，在加入As3+后4d時低濃度處理組的熒光強度低于對照組，J相和P相都得到一定恢復，表明As3+導致電子傳遞鏈受阻但并未中斷。

2.4不同濃度鎳和砷對銅綠微囊藻光合電子傳遞鏈參數的影響

    快速葉綠素誘導動力學曲線的光化學性能參數中包含的3個參數pDo、RC/CSo和ETo/ABS反映了植物光合機構的狀態和脅迫對光合機構的影響。在加入外源不同濃度Ni2+和As3+離子處理后，發現銅綠微囊藻的PSII反應中心受體側電子傳遞鏈受阻，反應中心活性降低，熱耗散增加（表2）。在處理4d后，Ni2+處理組銅綠微囊藻各光合參數繼續降低，但As3+處理的RC/CSo則升高，表明單位面積內反應中心的數量增加，說明在適應As3+處理一段時間后，銅綠微囊藻的適應能力增強。

3討論

    在藻類和高等植物中，光合電子傳遞由2個光反應（PS I和PSⅡ）中心串聯進行，在光合膜上PS I和PSⅡ通過包括質體醌(PQ)、Cyt b6/f復合體和質藍素(PC)在內的一系列電子傳遞體連結在一起，電子傳遞過程中在光合膜兩側建立的質子梯度可以驅動ATP的合成。葉綠素熒光反映了植物光合系統功能的變化狀況，如熒光參數值Fv/Fm的變化表明了PSⅡ原初光能轉換效率能力的大小，pDo表示用于熱耗散的量子比率，RC/CSo表示單位面積內反應中心的數量，ETo /ABS表示用于電子傳遞的量子產額等。

    在不同的環境條件下，O-J-I-P多相瞬態會改變形狀并提供大量的光合系統功能狀況的信息。因此，OJIP測定已經被廣泛應用于不同脅迫下各種光合放氧生物的研究。本文的研究結果發現，Ni2+脅迫下銅綠微囊藻PSⅡ活性（Fv/Fm)呈現顯著下降趨勢，OJIP曲線形狀發生改變，當Ni2+濃度達到0.8mg/L時，J相和P相已基本消失，pDo、RC/CSo以及ETo/ABS的變化（表2）均表明反應中心受體側電子傳遞鏈受到損傷，反應中心活性下降。Huang等的研究也表明，Ni2+脅迫銅綠微囊藻會導致ROS的增加，而大量的ROS會破壞細胞膜結構并引起DNA的損傷，從而影響光合系統的功能。As3+脅迫銅綠微囊藻時，低濃度處理組的PSⅡ活性有所上升，高濃度下降，與葉綠素a含量的變化趨勢基本一致，表現了銅綠微囊藻對低濃度As3+迫的耐受性。有大量的文獻報道，藍藻中存在類金屬硫蛋白使得藻細胞對低濃度的重金屬有一定的抗性，而砷可以誘導金屬硫蛋白的產生。因此本研究中銅綠微囊藻對低濃度的砷有一定的耐受性可能是因為藻細胞被砷誘導出類金屬硫蛋白，從而使其對低濃度的砷表現出一定的抗性。As和P都是第V主族元素，因此As034-在結構上與P034-艮相似，可以通過磷轉運途徑進入細胞?；铙w條件下氧化磷酸化和光合磷酸化的共同點是ATP合成均與電子傳遞偶聯，也就意味著若缺乏ATP的合成，電子傳遞就會受到限制，因此在As3+脅迫下銅綠微囊藻的光合活性降低可能是由于As3+進入磷轉運而導致ATP合成受到破壞，從而使電子傳遞鏈受到損傷。