聚磷菌透射電鏡超薄切片樣品制備過程的優化(環保)

              孟丹杰，  莊林杰，  王琦，  田晴*，  李方，  楊波

                 （東華大學環境科學與工程學院，上海201620）

摘要：透射電鏡樣品的制備條件與步驟會對聚磷菌（phosphorus accumulating orgmusms，PAOs）細胞內超微結構的觀察產生影響。以純培養、混合培養條件下生長的聚磷菌為觀測對象，在常規的透射電鏡制樣方法的基礎上，采用新的清洗、固定、染色策略，進而提出一種適合不同生長條件下聚磷菌的透射電鏡制樣新方法。實驗結果表明，新方法比常規方法更簡便有效；并且采用新方法制備樣品，不同培養條件下生長的PAOs體內聚磷(poly-Ps)顆粒在采用透射電鏡觀察時超微結構清晰、反差效果較好。

關鍵詞：透射電鏡；制樣；聚磷菌  中圖分類號：X172；TN16 doi:10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.020  文章編號：1003-6504(2016)06-0105-05

  隨著工業迅速發展，水體富營養化問題日益嚴重，而導致該問題的主要原因是磷過量，因此除磷技術成為控制水體富營養化的關鍵。除磷方法有很多種，其中最常用和經濟有效的是生物法。生物除磷過程中起關鍵作用的是聚磷菌（phosphorus accumulatingorganisms，PAOs），PAOs的除磷功能與其胞內聚合物如多聚磷酸鹽( poly-Ps)、聚羥基烷酸酯（PHAs）、糖原（glycogen）等有關。

  鑒于PAOs胞內聚合物的重要性，常對其進行定性和定量分析測定，一般通過染色并借助光學顯微鏡觀察PAOs體內poly-Ps顆粒的分布情況。然而，光學顯微鏡的分辨率僅為0.2μm，無法清晰觀測PAOs體內直徑在0.2μm以下的多聚物顆粒，而電子顯微鏡的分辨率可達1～2 nm。因此，需要采用具有高分辨率、高放大倍數的電子顯微鏡來對PAOs體內poly-Ps顆粒進行精確地定性及定量觀測。

    電子顯微鏡是研究生物超微結構的重要工具，

主要有掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）

和透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）

兩大類。TEM是把經加速和聚集的電子束投射到非  常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產生立體角散射，散射角的大小與樣品的密度、厚度相關，因此可以形成明暗不同的影像。TEM樣品的制備是準確觀察、測定PAOs胞內多聚物的重要保障。隨著透射電鏡樣品制備方法的不斷改進，超薄切片技術已成為最基本、最常用的透射電鏡生物樣品制備技術。

    常規的超薄切片技術的制樣過程比較復雜，一般為：取材、固定、清洗、脫水、浸透、包埋、超薄切片及染色等步驟。以常規方法中的固定步驟為例，通常采用戊二醛和四氧化鋨進行雙固定。然而，四氧化鋨（又名鋨酸），是一種非電解質強氧化劑，容易與核酸及多聚磷酸鹽等細胞內含磷單元反應，但也同樣會與細菌細胞內大量存在的C、O、N等嗜鋨元素反應形成黑色沉淀，對聚磷酸鹽的觀察產生干擾。此外，鋨酸滲透性差，對大分子聚合物的固定性差，因此不適合用于對體內多聚物種類豐富、含量高的聚磷菌的固定。并且不同生長條件下的聚磷菌具有不同的生長方式，例如混合培養條件下生長的聚磷菌會以菌膠團或者生物膜的方式聚集生長，細胞外存在大量由蛋白質、多糖等構成的胞外聚合物，對準確觀測聚磷菌菌體的超微結構帶來影響。

    因此在已有制樣方法的基礎上，針對純培養條件下以及混合培養條件下生長的聚磷菌，探索出新的透射電鏡超薄切片制樣方法，以便為清楚地觀察聚磷菌體內聚磷顆粒分布、研究聚磷菌生長過程中最優攝磷條件奠定基礎。

1試驗材料和方法

1.1試驗材料

    聚磷菌：所用到的聚磷菌有2種。(1)經分離、篩選與純化得到的純聚磷菌，并鑒定其為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida；(2)從實驗室運行穩定的厭氧——好氧交替式生物濾池( AABF)中取得的生物膜，即聚磷菌和具有除磷功能的其他細菌組合而成的混菌落。

    固定劑：戊二醛(2.5%)溶液。

    清洗劑：二甲砷酸鈉(SCB)緩沖溶液(0.1  mol/L)。

    染色劑：濃度為2%和10%的P b( NO₂)。溶液。

    脫水劑：30%、50%、70%、90%的梯度乙醇，1:1液（100%無水丙酮：100%無水乙醇），100%無水丙酮。

    包埋劑：環氧樹脂618。

1.2試驗方法

    實驗流程見圖1，即先采用常規TEMSP對純培養條件下的聚磷菌制樣，由于聚磷菌的特殊性，電鏡下未能分辨出菌體內poly-Ps顆粒。而改進清洗劑、固定劑、染色時序和切片厚度，電鏡觀察效果較好，便采用該改進方法對混合培養條件下的聚磷菌（生物膜）進行制樣，電鏡觀察效果并不理想，經對2種培養條件下聚磷菌的不同對比分析后，提高染色劑濃度、加長清洗時間再次對生物膜制樣，電鏡觀察效果良好。從而得到適合2種培養條件下聚磷菌的TEMSP。

1.2.1取材

    同常規制樣方法一樣，對2種生長條件下的聚磷菌取材時需遵循5個原則。(1) “快”：為使聚磷菌保持其生活狀態，需要在1—2 min內使所取樣品浸入固定劑；(2)“小”：電鏡固定劑穿透能力較弱，為了利于固定劑滲透到樣品中，需使樣品體積小于1 mm³; (3)“冷”：為防止聚磷菌細胞自溶，需要低溫操作來降低酶的活性，一般需在0～4℃低溫條件下操作；(4)“準”：為避免“一孔之見”，取材部位要準確；(5)“輕”：取材動作要輕，避免任何牽拉和擠壓損傷。

1.2.2清洗

    為防止清洗過程中PBS緩沖溶液中磷的干擾，可采用0.1 mol/L的SCB緩沖溶液來代替PBS緩沖溶液。也可用生理鹽水（0.85%的Na Cl溶液）代替0.1 mo/L的SCB緩沖溶液，以便維持溶液的pH以及滲透壓。

    具體清洗步驟為：將所取聚磷菌樣品置于1.5 m L離心管中，滴加適量0.1 mo/L的SCB緩沖溶液至浸沒聚磷菌樣品，以4000～5000 r/min轉速離心后棄上清液，重復上述操作10次（操作過程中離心轉速可以逐漸增大，至最后一次離心轉速為10000 r/min左右）。

1.2.3固定

    常用的固定劑有：四氧化鋨、醛類（戊二醛、甲醛等）。常規的透射電鏡生物樣品制備時采用戊二醛和四氧化鋨雙固定的方法：將樣品置于2.5%戊二醛(由0.2 mol/L的磷酸(PBS)緩沖溶液配制）固定液中，4℃固定2h或更長時間；固定后用0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH=7.2~7.3)漂洗3次；漂洗后再用i%鋨酸固定液4℃固定1~2 h；最后用0.1 mol/L的PBS緩沖溶液漂洗3次，以上每次漂洗時間均為15～20 min。然而，四氧化鋨（又名鋨酸），是一種非電解質強氧化劑，容易與核酸及多聚磷酸鹽等細胞內含磷單元反應，會與細菌細胞內大量存在的C、O、N等嗜鋨元素反應形成黑色沉淀，進而對聚磷酸鹽的觀察產生干擾。此外，鋨酸滲透性差，對大分子聚合物的固定性差，因此不適合用于體內多聚物種類豐富、含量高的聚磷菌的固定。戊二醛可以保持酶的活性，用它作為固定劑時，不會使細胞或組織變脆，固定時間最長可達1個月。并且戊二醛具有分子量小、滲透性好，能同時固定細胞內的基質、糖原、核酸、聚磷等成分。因此制備聚磷菌的透射電鏡樣品時，只需用戊二醛作為固定液。2.5%的戊二醛固定液(pH=7.4)的配制：0.2 mol/L的二甲砷酸鈉(SCB)緩沖溶液25mL，25%的戊二醛5 m L，滴加重蒸水( d d H₂O)至50mL。

  將所取聚磷菌樣品用0.1mo/L的SCB緩沖溶液充分清洗后，置于2.5%的戊二醛固定液(pH=7.4)中，于4℃且不見光的環境下固定至少2 h。固定結束后采用1.2.2節所述方法對樣品清洗3次。注意加入固定液時，需沿離心管壁緩慢加入，以保證聚磷菌細胞團聚；并且固定液需加至管蓋處，以防絮體在移動樣品過程中破碎。

1.2.4染色

1.2.4.1染色劑的種類及其染色時序的改進

    常規的透射電鏡制樣過程中的染色僅在超薄切片制好后，用3%醋酸鈾與枸櫞酸鉛進行雙染色。然而，對聚磷菌的透射電鏡樣品制備時若采用該染色方法會造成細胞內所有組成均被染成灰色或黑色，很難分辨聚磷菌體內的poly-Ps顆粒。因此，需要在細胞仍具有一定活性時（脫水前），采用能夠與磷形成沉淀的Pb( NO₃)₂溶液進行染色。

    由于采用Pb (NO₃)₂溶液染色后，已經可以清晰分辨電鏡所拍攝的poly-Ps顆粒，無需在樣品包埋切片后繼續染色。因此將細菌包埋切片后染色改為細菌脫水前染色。

1.2.4.2不同生存狀態下的聚磷菌的染色要求

    對于純培養條件下生長的聚磷菌和混合培養條件下生長的聚磷茵，需要采用不同濃度的Pb( NO₃)₂溶液(2%~10%)進行染色。在純培養條件下，培養基內營養充分，聚磷菌在液體培養基內形成濁度比較高的細菌溶液，菌體聚集度小，保持分散生長狀態，胞內的多聚物數量較少，因此，對純培養條件下生長的聚磷菌染色時，可以采用低濃度的Pb( NO₃)₂溶液(2%)進行染色1h。但如果聚磷菌樣品來自混合培養的生長條件，聚磷菌胞外存在大量多聚物（由蛋白質與多糖構成），會限制染色過程中Pb( NO₃)₂溶液的擴散，為減少染色時間，可根據菌膠團與生物膜老化程度改變Pb( NO₃)₂溶液濃度，如對生物膜內聚磷菌染色可采用高濃度的P b( NO₃)₂溶液(10%)染色1h，才能夠保證P b( NO₃)₂溶液能充分滲透進入生物膜內聚磷菌體內，對poly-Ps顆粒染色成功。注意Pb( NO₃)₂溶液需要現配現用；并且染色后的清洗次數要隨染色液濃度的提高而適當增加。染色結束后仍采用1.2.2節所述方法對樣品清洗3次。

1.2.5脫水

    同常規方法，采用梯度乙醇-丙酮系列脫水法：先用濃度分別為30%、50%、70%、90%的乙醇各脫水1次，再用1:1液（100%無水丙酮：100%無水乙醇）脫水1次，最后用100%無水丙酮脫水3次，以上每次脫水時間均為15~20min。

1.2.6滲透和包埋

    先將樣品浸透，即取適量100%無水丙酮和包埋劑（1.1節所述）的混合液（V/V=1:1），移至裝有經以上處理的樣品的離心管中，使混合液淹沒樣品，打開離心管蓋并靜置過夜。然后將滲透后的樣品包埋，即加純包埋劑滲透2h（樣品需在1min之內浸到包埋劑底部，若樣品懸浮在樹脂中，則要加少許丙酮至樣品沉到底部并過夜，第2天換純包埋劑浸透12～24 h）。

最后將樣品聚合：即先把包埋劑注入包埋板孔中，再將樣品從離心管中取出迅速擺放在包埋板孔中，聚合溫度和時間：35℃，16h;45℃.24h；60℃，48h。自然降溫，待切片。

1.2.7切片

    包埋塊在超薄切片機中切片。由于切片質量直接關系到電鏡觀察的結果，因此超薄切片是樣品制備的關鍵環節。電子穿透能力較弱，樣品必須制成厚度小于0.1m的超薄切片，常用的超薄切片厚度是50~60 nm，這一厚度的超薄切片在電子束轟擊過程中容易產生振動（難于維持穩定），會影響電鏡觀察與拍攝過程效果。

    為了提高透射電鏡圖片的清晰度，可以將超薄切片的厚度增加到90nm。

2結果與討論

采用常規TEM超薄切片制樣方法對純培養條件下的聚磷菌進行制樣，即用戊二醛和鋨酸雙固定、PBS緩沖溶液清洗、切片后再用3%醋酸鈾與枸櫞酸鉛進行雙染色，在透射電鏡下觀察，結果如圖2(a)所示，聚磷菌細胞內所有組分均被染成灰色或黑色，無法分辨出菌體內的poly-Ps顆粒，并且緩沖溶液中的磷會殘留在細胞表面與固定劑反應，干擾poly-Ps顆粒的觀測。    

改變清洗劑和染色條件再次對純培養條件下的聚磷菌進行制樣，即將染色劑改為2%的Pb( NO₃)₂溶液并將染色步驟改至脫水前，且用0.1 mol/L的SCB溶液代替PBS緩沖溶液，但仍采用2.5%的戊二醛和1%的鋨酸進行雙固定，在透射電鏡下觀察，結果如圖2(b)所示，由于鋨酸會與菌體內的poly-Ps顆粒反應，無法正確反映poly-Ps顆粒的數量及分布情況，且細胞內大量存在的C、N、O等噬鋨元素與鋨酸反應生成黑色沉淀，同樣干擾菌體內poly-Ps顆粒的觀測。

    改變固定方式再次對純培養條件下的聚磷菌進行制樣，即對比圖2(b)所述制樣方法，除固定時僅采用2.5%戊二醛進行固定外，其他制樣過程不變，在透射電鏡下觀察本制樣條件下獲得的樣品，結果如圖2(c)所示，不僅能清晰觀測到聚磷菌體內poly-Ps顆粒的數量和分布情況，還能觀測其形狀，并且細胞結構完整。比較圖2(a)、(b)、(c)表明：僅使用2.5%的戊二醛作為固定劑，用0.1 mol/L的SCB代替PBS緩沖溶液，且采用2%的Pb( NO₃)₂溶液進行脫水前染色，即可達到純培養條件下生長的聚磷菌體內poly-Ps顆粒的觀測目標。

    然而，對于混合培養條件下生長的聚磷菌，由于其大部分細胞在胞外聚合物作用下聚集生長，實驗初期，僅采用上述針對純培養聚磷菌的制樣方法獲得的樣品，在透射電鏡下觀察后，發現染色后的聚磷菌體內并無任何黑色顆粒物，說明染色不充分，需要提高染色劑濃度并延長染色時間。

    為節約制樣時間，本研究提高Pb( NO₃)₂染色劑濃度，即將硝酸鉛溶液的濃度由2%提高到10%，其它制樣條件不變，再次對混合培養條件下生長的聚磷菌進行制樣，在電鏡下觀察，結果如圖2(d)所示?？梢园l現，雖然染色劑濃度提高5倍，并未對菌體內組分觀察產生影響（菌體內組分顏色并未因此加深），菌體內、外的黑色顆粒物清晰可見，說明Pb選擇性地與細胞內外的磷反應生成黑色的沉淀物，該結果與文獻所報道的采用化學分析法獲得的磷在聚磷菌體、內外分布結果一致：即，廢水中的磷可以被聚磷菌能夠吸收，部分磷被聚磷菌利用在體內合成poly-Ps、部分磷會被聚磷菌胞外的多聚物（主要由蛋白質與多糖構成）通過吸附、網捕作用固定在細胞表面。

    上述結果表明，純培養聚磷菌多為分散生長，在觀測中，沒有在菌體周圍發現明顯的胞外聚合物，因此，采用低濃度的Pb( NO₃)₂溶液，便可保證Pb²⁺能在既定的染色時間(1 h)內滲入聚磷菌細胞內，保證對聚磷菌體內的磷顆粒染色。而對于混合培養的聚磷菌，在觀測中，可以發現聚磷菌細胞外存有大量的多聚物，這些多聚物不僅因為含有磷而消耗染色劑中的Pb²⁺，而且因其大量存在所形成的空間位阻，會降低Pb²⁺向細胞內的滲透性。因此，為保證對混合培養條件下聚磷菌體內磷充分染色，需要提高染色液內Pb²⁺濃度。因此僅使用2.5%的戊二醛作為固定劑，用0.1 mol/L的SCB代替PBS緩沖溶液，且采用10%的Pb( NO₃)₂溶液進行脫水前染色，就可以達到混合培養條件下生長的聚磷菌體內poly-Ps顆粒的觀測目標。

3結論

    總結上述過程，聚磷菌的透射電鏡制樣過程為：取材、清洗、固定、清洗、染色、清洗、脫水、浸透與包埋、切片、電鏡觀察。其中純培養和混合培養條件下的聚磷菌除染色時所用的Pb(NO₃)₂溶液濃度不同及染色后清洗時間長短不同外，制樣的其他步驟相同。

    由透射電鏡觀察結果知，采用常規透射電鏡生物制樣方法對聚磷菌制樣時，無法清晰辨別聚磷菌的細胞質與其胞內聚合物；采用改進后的制樣方法制備聚磷菌樣品時，操作簡便，并且固定徹底、滲透均勻，染色清晰，聚磷菌細胞內結構完整，易于區分細胞質與胞內聚合物，圖像反差效果好。